作者：郑旭锐，孙守才，李长秦，胡建军

【摘要】  　　目的观察加味四逆散对肝纤维化大鼠肝组织Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ型胶原的影响效果，从而探讨该方抗肝纤维化的机理。方法采用二甲基亚硝胺腹腔注射制备大鼠肝纤维化模型，加味四逆散灌胃给药，免疫组织化学方法检测分析各组大鼠肝组织Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ型胶原的含量。结果加味四逆散能明显降低肝纤维化大鼠肝组织Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ型胶原的含量，与病理模型组比较有显著性差异（P<0.05）。结论加味四逆散可有效的减少肝组织Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ型胶原的沉积，对肝纤维化有肯定的治疗作用。

【关键词】  加味四逆散； 肝纤维化； Ⅰ型胶原； Ⅲ型胶原； Ⅳ型胶原

　　Abstract：ObjectiveThe mechanism  of Chinese herbail compound  JIA WEI SI  NI  SAN in treating hepatic fibrosis were explored and studied  by observing  the expression of Collagen Ⅰ，Ⅲ and Ⅳ Collagen  in  liver.MethodsThe rat fibrosis model was induced by DMN.  The groups of  treatment were fed  with  JWSNS gavage. Ⅰ，Ⅲand Ⅳ  collagen were  detected  in  liver samples with immunohistochemisty. ResultsUpon pathological  examination ,the JWSNS  treatment had significantly  reversed  DMN-induced liver  fibrosis .  In  JWSNS  treatment group  the  expression of collagen  Ⅰ,Ⅲand Ⅳcollagen  in  liver  was  markedly  reduced  respectively  according   to immunohistochemisty  analysis  as  compared  with  model  group（P<0.05）. ConclusionThe  mechanism  of  treating  hepatic fibrosis  with  JWSNS  appears to due to  the  enhancement  of  degradiation  of  collagen  in  liver.  JWSNS  can  treat  hepatic  fibrosis  effectively.

　　Key words：JWSNS ；  Hepatic fibrosis ；  Collagen Ⅰ；   Collagen Ⅲ；  Collagen Ⅳ
   
　　加味四逆散是治疗慢性病毒性肝炎的有效经验方，既往的临床观察和动物实验研究已经证实该方具有良好的防治肝纤维化作用［1～3］。本研究观察加味四逆散对肝纤维化大鼠肝组织Ⅰ型胶原（CoL-Ⅰ）、Ⅲ型胶原（CoL-Ⅲ）、Ⅳ型胶原（CoL-Ⅳ）影响效果，探讨加味四逆散抗肝纤维化的药理机制、作用环节。

　　1    材料

　　1.1    动物   雄性SD大鼠50只，体重（180±20）g，由第四军医大学实验动物中心提供。

　　1.2     药物及试剂   加味四逆散煎剂（由柴胡、枳壳、白芍、甘草、黄芪、丹参、桃仁等药组成），药物加水浸泡常规煎煮，过滤，水浴蒸发至每毫升含生药3.75g，置于4℃冰箱保存备用。秋水仙碱（云南医药集团云南药业有限公司）；二甲基亚硝胺(DMN，美国Sigma公司)；CoL-Ⅰ，CoL-Ⅲ，CoL-Ⅳ抗体（均为0.1 ml兔抗鼠浓缩型，武汉博士德生物制品公司）。免疫组化试剂盒由第四军医大学免疫组化室提供。

　　2    方法

　　2.1    模型制备   50只大鼠随机选取8只作为空白对照组（A ），其余42只均用二甲基亚硝胺（用生理盐水稀释至5 mg/ml）以10 ml/kg体重腹腔注射，1次/d，每周连续3 d，连续4周。

　　2.2  分组  4周造模结束后，42只大鼠共死亡10只，死亡率为23.8%，将剩余32只造模大鼠随机分为：病理模型组（B）12只 ；秋水仙碱组（C）10 只；中药组（D）10只。

　　2.3   给药A、B组：以生理盐水4ml/只灌胃；C组：以秋水仙碱0.01mg/kg体重灌胃；D组：以加味四逆散煎剂20ml/kg体重灌胃。以上各组用药均1次/d，连续用药30d后结束。

　　2.4    标本采集与制备   实验结束时，B组大鼠死亡2只，死因可能为肝纤维化未经治疗进行性加重导致肝硬化腹水而死亡。将其余存活大鼠断头处死取新鲜肝组织左叶，10%甲醛固定，石蜡包埋，连续切片，片厚5μm。

　　2 .5    观测指标及测定方法

　　2.5.1    一般表现   精神、活动、饮食、皮毛、粪便等。

　　2.5.2     普通病理组织学检查    将各组石蜡切片均行常规HE染色及胶原纤维染色。光镜下观察。病理组织学分级标准为［4］：“-”级：正常肝脏或无明显胶原纤维增生；“±”级：胶原纤维增生，中央静脉和汇管区有少量纤维索放散延伸，但无间隔形成；“+”级：胶原纤维增生，中央静脉和汇管区结缔组织变厚，由此向四周伸出纤维索，形成不完全间隔；“++”级：胶原纤维大量增生，有个别菲薄的完全间隔形成（假小叶）；“+++”级：完全间隔较厚，假小叶大量形成。

　　2.5.3    肝组织CoL-Ⅰ、CoL-Ⅲ、CoL-Ⅳ免疫组化观察石蜡切片，免疫组化染色按试剂盒说明进行，SP染色法，DAB法显色。CoL-Ⅰ，CoL-Ⅲ，CoL-Ⅳ含量以半定量的分级方式，根据显色深浅，分布范围及密度，分别划为4个等级［5］。0级：阴性；1级：较少，着色浅，高倍镜下明确阳性；2级：少量，着色中等，低倍镜下明确阳性；3级：大量，条索状或小片状分布，着色深。

　　2.6    统计学处理方法   采用Ridit分析。

　　3  结果

　　3.1    加味四逆散对大鼠症状表现的影响实验期间空白对照组大鼠一直精神状态佳，皮毛光滑密泽，紧贴身体，大便正常，进食无异常。所有造模组大鼠，则出现不同程度的精神不振，反应迟钝，饮食摄水明显减少，粪便稀薄，皮毛凌乱，缺乏光泽；治疗组于治疗3周后，大便逐渐干燥，进食、摄水增加，精神状态亦随之好转。

　　3.2    加味四逆散对肝CoL-Ⅰ，CoL-Ⅲ，CoL-Ⅳ的影响实验结束后免疫组化结果显示：空白对照组在汇管区及中央静脉等处可见CoL-Ⅰ，CoL-Ⅲ，CoL-Ⅳ沉积，但量极少，染色较淡，几乎为阴性。而模型组的汇管区及中央静脉等处可见大量CoL-Ⅰ，CoL-Ⅲ，CoL-Ⅳ沉积，数量极大，成条索状或小片状分布，着色深。中药组及秋水仙碱组肝组织Ⅳ型胶原沉积较模型组为轻，着色浅，大部分在高倍镜下才明确阳性。经统计学分析中药组及秋水仙碱组与模型组比较有显著性差异（P<0.05）。中药组稍优于秋水仙碱组，但两者经统计无显著性差异（P>0.05）。见表1。

　　表1  肝C0L-Ⅰ，C0L-Ⅲ，C0L-Ⅳ在各组大鼠中的分级结果（略）

　　与 B组比较 ，*P<0.05；与C组比较，△P>0.05

　　3.3  加味四逆散对肝纤维化组织病理学的影响    实验结束后，光镜下观察可见：空白对照组：HE染色见肝组织结构清晰，胶原纤维染色仅于汇管区和中央静脉有少许胶原纤维存在。模型组：HE染色见肝组织结构欠清晰，汇管区及小叶内中度炎性细胞浸润；胶原纤维染色显示汇管区大量胶原沉积，呈较宽的条索状纤维深入肝小叶。各治疗组大鼠仅见轻度汇管区炎症，胶原纤维染色显示纤维结缔组织增生程度减轻，以中药组和秋水仙碱组作用明显，与模型组比较有显著性差异（P<0.05）。免疫组化检测结果与普通病理组织检查结果基本一致，说明加味四逆散组对肝纤维化有良好的治疗作用。见表2。

　　表2  肝纤维化各组大鼠肝脏病理组织学变化（略）

　　与B组比较，*P<0.05

　　4  讨论
   
　　肝纤维化是许多慢性肝病发展的普遍后果，近年来研究发现星状细胞(HSC)是肝纤维化形成的关键。HSC活化后不仅细胞大量增殖，而且还表现为细胞个体分泌纤维能力增强，大量生成ECM，其中以胶原成分为主，尤以CoL-Ⅰ，CoL-Ⅲ，CoL-Ⅳ增多最为显著，并可自分泌TGFβ1，血小板衍生因子等细胞因子维持自身活化状态。故减少胶原在细胞外的沉积可能阻止肝纤维化。本实验结束后动物一般症状表现显示：加味四逆散组大鼠活动度较好，皮毛较密集光泽，饮水、进食情况良好，粪便较干燥。免疫组化结果显示，加味四逆散治疗组大鼠肝组织CoL-Ⅰ，CoL-Ⅲ，CoL-Ⅳ沉积较模型组明显减少和降低（P<0.05），反映了加味四逆散可有效的促进CoL-Ⅰ，CoL-Ⅲ，CoL-Ⅳ的降解，推测其机制可能为抑制HSC活化与增殖，减少CoL-Ⅰ，CoL-Ⅲ，CoL-Ⅳ在细胞内的沉积从而发挥其抗肝纤维化的作用。

【参考文献】
  　　［1］ 孙守才,刘光炜.加味四逆散治疗慢性乙型肝炎肝纤维化的初步研究［J］. 陕西中医学院学报,2001,24（1）:46.

　　［2］ 孙守才,李晓苗,曾福海，等. 加味四逆散防治大鼠免疫性肝纤维化的实验研究［J］. 陕西中医学院学报,2002,25（2）：26.

　　［3］ 孙守才,刘光炜,曾福海，等. 加味四逆散对肝纤维化大鼠血清透明质酸、层粘连蛋白、Ⅳ型胶原及肝脏超微结构的影响［J］. 中国中医基础医学杂志,2002,11:56.

　　［4］ 中华医学会传染病寄生虫病学分会、肝病学分会.病毒性肝炎防治方案［S］.2000年9月西安会议.

　　［5］ 施光锋,翁心华，徐肇玥，等. 秋水仙碱对血吸虫病肝纤维化小鼠肝脏Ⅰ、Ⅲ、Ⅵ型胶原蛋白表达的影响［J］. 中华传染病杂志,2000,18（3）:180.